Raríssimos esqueletos completos de dinossauros, múmias egípcias, as maiores coleções clássicas e indígenas do continente e a maior biblioteca de antropologia da América Latina faziam parte do acervo, considerado completamente perdido, do Museu Nacional. O arquivo se constituiu ao longo de 200 anos e era composto por mais de 20 milhões de itens catalogados, o que fazia dele a maior coleção de história natural e antropologia da América Latina e o quinto maior museu mundial de história natural.
Entre as raridades estavam os restos de Luzia, o nome do mais antigo fóssil humano encontrado nas Américas, datado de cerca de 11.500 a 13.000 anos. A descoberta, na década de 1970, reacendeu o debate sobre as origens do homem americano, mais antigas que o pensado anteriormente.
Composta por mais de 100 mil itens e iniciada por D. Pedro I, a coleção arqueológica reunia peças de grande importância provenientes de diversas civilizações que habitaram as Américas, a Europa e a África, desde o Paleolítico até o século XIX.
Entre elas estava o sarcófago em madeira policromada da cantora de Ámon, Sha-Amun-en-su, da Época Baixa, dado de presente a Pedro II durante sua segunda viagem ao Egito, em 1876. O sarcófago nunca foi aberto e conservava a múmia da cantora em seu interior, característica que lhe conferia notória raridade. Outros sarcófagos e múmias também integravam o acervo egípcio, o maior do continente.
O acervo paleontológico incluía fósseis de dinossauros, animais e plantas. Dentre eles estava um titanossauro de treze metros de comprimento e nove toneladas de peso, datado do Cretáceo Superior e coletado em Minas Gerais.
O museu tinha também a maior coleção de meteoritos do país, incluindo o Meteorito do Bendegó, o maior já encontrado no país e um dos maiores do mundo, descoberto na Bahia, em 1784.
O Museu Nacional conservava também um importante conjunto de aproximadamente 1.800 artefatos produzidos pelas civilizações ameríndias durante a era pré-colombiana, além de múmias andinas.
As coleções dividiam-se em ciências naturais (geologia, paleontologia, botânica e zoologia) e antropológicas (antropologia biológica, arqueologia e etnologia). Diversos núcleos do acervo remontam a coleções iniciadas ainda no século XVIII.